高效毛细管电泳色谱仪简称毛细管电泳仪（CE），是以毛细管为分离通道，以电渗流为驱动力，利用带电粒子之间的电泳淌度差异和分配系数差异进行分离，电泳淌度不同是电泳分离的内因和前提。

一、电泳：

1、电泳现象：

电泳现象是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。

2、电泳技术：

电泳技术是指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。

3、电泳速度v_ep：

电泳速度v_ep是指带电粒子在单位电场强度下泳动的速度。

带电粒子在电场中迁移时，所受的电场力为F_E：

F_E = qE

式中：q为带电粒子的有效电荷，E为电场强度。

带电粒子在溶液中运动时受到的阻力即摩擦力F_f：

F_f = fv_ep

式中：f为摩擦系数，其大小与带电粒子的大小、形状和电泳介质粘度有关。

对于球形粒子：f = 6πηr

对于棒状粒子：f = 4πηr

式中：η为电泳介质粘度，r为粒子的动力学半径。

平衡时，电场力和摩擦力相等，即：

qE = fv_ep

对于球形粒子：v_ep =（qE）/f =（qE）/（6πηr）

对于棒状粒子：v_ep =（qE）/f =（qE）/（4πηr）

在同一电场中，粒子的电荷性质不同，泳动方向不同；粒子的带电量不同，泳动速度不同；粒子的分子量不同，泳动速度不同；粒子的形状不同，泳动速度不同。因此，不同的粒子可相互分离。

4、电泳淌度μ_ep：

带电粒子在电场中移动的快慢用电泳淌度来表示，一般不用电泳速度表示。

电泳淌度是指带电粒子在给定的溶液中，在单位电场强度下的电泳速度，又称电泳迁移率或泳动度。用μ_ep表示。

对于球形粒子：μ_ep = v_ep/E = q/（6πηr）

对于棒状粒子：μ_ep = v_ep/E = q/（4πηr）

带电粒子的电泳速度等于粒子的电泳淌度和电场强度的乘积，即：

v_ep =μ_epE

因此，电泳淌度不同是电泳分离的内因和前提。

电泳淌度有绝对电泳淌度、有效电泳淌度和表观电泳淌度。

（1）绝对电泳淌度µ_ab：

绝对电泳淌度是指在溶液无限稀释时，带电粒子在单位电场强度下的平均电泳速度。它是该带电粒子在一定溶液中的一个特征物理常数。

（2）有效电泳淌度µ_ef：

CE不可能在无限稀释而又没有其它带电粒子和酸度等条件下进行电泳，有效电泳淌度是带电粒子的实际电泳淌度。

（3）表观电泳淌度μ_ap：

在有电渗存在下，带电粒子的实际电泳淌度称为表观电泳淌度或净淌度，是有效电泳淌度µ_ef和电渗淌度µ_eo的矢量和。

二、CE中的Zeta电位：

1、毛细管内表面的Zeta电位：

毛细管一般采用石英管，管内表面为硅胶，当内充缓冲液pH＞3时，管内表面的硅醇基（－SiOH）离解成硅醇基阴离子（－SiOˉ），使管内表面带负电荷，溶液表面带正电荷，在管内表面和溶液之间形成双电层。根据Stern双电层理论可将双电层分为两部分，即Stern层和扩散层。

在双电层中，由于吸附而紧贴在毛细管内表面的阳离子组成的离子层称为Stern层，可游离的阳离子组成的离子层称为扩散层。Stern层与扩散层发生相对移动的界面称为滑动面，滑动面和毛细管内表面的电位差称为毛细管内表面的Zeta电位（ζ－电位）。毛细管内表面的Zeta电位正比于双电层厚度和滑动面的有效电荷密度，反比于电泳介质的介电常数。

2、胶体粒子的Zeta电位：

在胶体中，由于分散粒子表面带电荷而吸引周围的反离子，这些反离子在两相界面呈扩散状态分布而形成双电层。

在双电层中，由于吸附而紧贴在分散粒子表面的反离子组成的离子层称为Stern层。Stern层中的反离子和分散粒子紧紧地结合在一起，在电场作用下，与分散粒子作为一个整体移动。Stern层相对于远离滑动面的液体中某点的电位称为Stern电位。

在双电层中，可游离的反离子组成的离子层称为扩散层，游离离子的电荷密度随着与分散粒子表面的距离的增大而急剧减小。扩散层中的反离子不紧密的与分散粒子相互吸附，在电场作用下，向相反的电极方向移动。Stern层与扩散层发生相对移动的界面称为滑动面，滑动面和远离该界面的液体中某点的电位差称为该点的Zeta电位（ζ－电位）。

Zeta电位是表征胶体分散系稳定性的重要指标。

三、电渗：

1、电渗现象：

电渗现象是指在电场作用下，毛细管中液体沿毛细管内表面或或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。

毛细管一般采用石英管，管内表面为硅胶，当内充缓冲液pH＞3时，管内表面的硅醇基（－SiOH）离解成硅醇基阴离子（－SiOˉ），使管内表面带负电荷，溶液表面带正电荷，在管内表面和溶液之间形成双电层。在外电场作用下，溶液中溶剂化了的阳离子向负极移动，使毛细管中的溶液整体向负极移动。这就是CE中的电渗现象。

2、电渗流（EOF）：

电渗现象中整体移动着的液体称为电渗流。

电渗流来源于外电场对毛细管内表面和溶液之间双电层的作用。扩散层中的阳离子相对于毛细管内表面的负电荷形成一个圆筒形的阳离子鞘，在外电场作用下，溶液中溶剂化了的阳离子沿滑动面作相对运动，携带着溶剂一起向负极移动，而形成电渗流。

电渗流是CE的主要驱动力，沿毛细管均匀分布，电渗流的径向分布几乎是均匀的，使整个液体象塞子一样以均匀的速度向前运动，呈平面流（塞式流形）。电渗流速度除在管内表面附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等，引起的谱峰展宽很小。而HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在管内表面处的速度为零，管中心的速度是平均速度的两倍，引起的谱峰展宽较大。这是CE能获得比HPLC更高分离效率的主要原因。

电渗流使不同电性的粒子均向负极移动，中性分子也随电渗流一起移动。

3、电渗流速度v_eo：

（1）电渗流大小：

电渗流大小用电渗流速度v_eo表示，其大小决定于电渗淌度μ_eo和电场强度E。即：

v_eo =μ_eoE =（εζ/η）E

v_eo可通过实验测定：

v_eo = L_ef/t_eo

式中：L_ef为毛细管有效长度，t_eo为电渗标记物（中性物质）的迁移时间。

（2）电渗流方向：

电渗流方向取决于毛细管内表面的电荷性质。

石英毛细管内表面带负电荷，溶液表面带正电荷，电渗流流向负极。但如果将毛细管内表面改性和加电渗流反向剂，使管内表面带正电荷，则溶液表面带负电荷，电渗流流向正极。

1）毛细管内表面改性：在毛细管内表面键合或涂渍一层阳离子表面活性剂。

2）加电渗流反向剂：在运行缓冲液中加入大量阳离子表面活性剂，使毛细管内表面带正电荷，溶液表面带负电荷，电渗流流向正极。

4、电渗淌度μ_eo：

μ_eo =εζ/η

电渗淌度又称电渗迁移率，取决于毛细管内表面的Zeta电位、电泳介质的介电常数和电泳介质粘度，与E无关。

5、电渗流作用：

电渗流通常流向负极，电渗流速度约是一般离子电泳速度的5～7倍。各种粒子在毛细管中的迁移速度是电渗流速度和电泳速度的矢量和，称为表观电泳速度v_ap。各种粒子在毛细管中的表观电泳速度v_ap分别为：

阳离子：v_ap = v_eo+ v_ep，阳离子电泳方向与电渗流方向一致。

阴离子：v_ap = v_eo－v_ep，阴离子电泳方向与电渗流方向相反。

中性粒子：v_ap = v_eo，中性粒子运动方向与电渗流方向一致。

当样品从正极端注入毛细管中时，不同粒子将以不同速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管，出峰顺序依次是阳离子、中性粒子和阴离子。中性粒子无电泳现象，随电渗流同行，在阳离子后流出，但不同结构的中性粒子无法相互分离。

电渗流在CE中起着极其重要的作用：

（1）电渗流具有象HPLC中泵一样的作用，驱动粒子前进，加上不同粒子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性粒子的分离。

（2）改变电渗流的大小和方向，可改变分离效率和选择性。这是CE优化分离的重要因素。

（3）电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积）。

6、控制电渗流的三个重要手段：

（1）毛细管内表面改性：

在毛细管内表面键合或涂渍一层阳离子表面活性剂，消除电渗流的影响。

（2）加添加剂：

1）有机溶剂可降低电渗流的大小，增加分离的有效距离。

2）表面活性剂可彻底改变电渗流方向和大小。主要是在阴离子分析时使用。

（3）改变pH：

可调整电渗流大小。

1）当pH＜3时，电渗流很小。

2）当pH＞10时，电渗流基本不增加。

四、影响电泳迁移速度的因素：

影响电泳迁移速度的因素有粒子所带净电荷量、粒子大小及形状、毛细管材质、载体、电场强度、缓溶液pH值、缓冲液离子强度、添加剂、温度和电渗流等。

1、粒子所带净电荷量：

粒子的迁移速度与粒子所带净电荷量成正比。

2、粒子大小及形状：

粒子直径小，接近于球形，迁移速度快。

一般来说，迁移速度为超螺旋环状DNA＞线状DNA＞单链开环DNA。

3、毛细管材质：

不同材料毛细管内表面的电荷特性不同，产生的电渗流大小不同。

4、载体：

（1）载体孔径：

载体孔径越小，粒子在移动的过程中受到的阻力越大。

小孔径载体具有分子筛作用。

（2）载体粘性：

阻碍泳动并有吸附作用。

载体的吸附作用要小，否则电场强度不均匀，影响区带分离。

（3）载体纯度：

载体纯度影响聚焦效果。

酸度影响毛细管内表面Si－OH基的电离。特别是在pH = 4～7范围内影响更显著，此时溶液pH值与电渗速度近似成线性关系。

5、电场强度：

一般来说，电场强度越大，粒子的迁移速度越大。

6、缓溶液pH值：

缓冲液pH值是影响粒子电泳淌度的最主要因素。

（1）缓冲液pH值决定粒子的解离程度，也决定粒子的带电性质和所带净电荷量。

（2）缓冲液pH值影响毛细管内表面电荷多少，影响电渗流大小和迁移速度。

缓冲液pH值增大时，毛细管内表面解离增多，电荷密度增加，Zeta电位增大，电渗流速度增大，当pH = 7时达到最大。当pH＜3时，完全被氢离子中和，管内表面呈电中性，电渗流速度为零。

7、缓冲液离子强度：

缓冲液离子强度越大，粒子的迁移率越小，电泳区带窄而清晰。原因是缓冲液离子强度增大，带电离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，形成一个与该离子符号相反的离子氛，使该离子向相反的方向运动，从而降低该离子的迁移率。缓冲液离子强度过大，电流过大，产生的热量过多，会使电泳区带变宽，蛋白质变性。

缓冲液离子强度越小，粒子的迁移率越大，电泳区带宽而边缘模糊。缓冲液离子强度过小，会降低缓冲液的总浓度和缓冲容量，不易维持缓冲液pH值，影响粒子的带电量；蛋白质分子之间有时会发生静电作用，形成更大的分子团，影响迁移率。

8、添加剂：

添加剂有中性盐、表面活性剂和有机溶剂等。

（1）加入浓度较大的中性盐如K₂SO₄，溶液离子强度增大，电渗流速度减小。

（2）加入表面活性剂，可改变电渗流大小和方向。

1）某些阳离子表面活性剂使电渗流减小。

2）某些阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠（SDS），可使管内表面负电荷增加，电渗流增大。

（3）加入有机溶剂如甲醇和乙腈，使溶液粘度减小，电渗流增大。

（4）加入添加剂，增加疏水组分的溶解度，扩大分离对象。

9、温度：

电泳过程中，由于通电会产生焦耳热，焦耳热对电泳影响很大。温度每变化1℃，将引起背景电解质溶液的粘度变化2%～3%，迁移率增加约2.4%。为了降低热效应对电泳的影响，可控制电压、电流和在电泳系统中安装冷却散热装置。

10、电渗流：

（1）改变电渗流大小和方向可改变分离效率和选择性。

（2）电渗流的微小变化会影响分离结果的重现性。

   

来源：http://www.fudizao.com