琼脂糖凝胶电泳色谱仪是以琼脂糖凝胶作为载体的电泳技术，广泛用于核酸研究，为DNA分子及其片段的分子量测定和DNA分子构象分析提供了重要手段。

一、工作原理：

琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移率与其分子量的常用对数成反比。DNA分子构象对迁移率也有影响，迁移率为共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。琼脂糖凝胶电泳中，DNA和RNA从负极向正极移动。

二、琼脂糖凝胶制备：

琼脂糖是从琼脂中精制出来的白色胶状多糖，是由1，3连接的β－D吡喃半乳糖和1，4连接的3，6脱水β－D吡喃半乳糖交替而成的中性物质。琼脂糖由于氢键和其它力的作用使其相互盘绕成绳状琼脂糖束，而形成大网孔型凝胶。

琼脂是从海藻中提取出来的多糖体，主要由琼脂糖（约占80%）和琼脂胶组成。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，从琼脂胶中脱去硫酸酯基和丙酮酸酯基可获得琼脂糖。琼脂胶和琼脂糖的结构相似，但由于琼脂胶含硫酸根和羧基，凝胶能力差；琼脂糖中存在极微量的硫酸根和丙酮酸酯基取代电离基团，在电场作用下能产生较强的电渗；硫酸根可与某些蛋白质作用，从而影响电泳速度和分离效果。因此，在琼脂糖制备过程中需要把琼脂胶尽量除去。质量较好的琼脂糖的硫酸根含量较低，通常小于0.2%，电渗较小。

三、琼脂糖凝胶种类：

1、高纯度琼脂糖凝胶：适用于DNA的分离和鉴定。

2、高强度琼脂糖凝胶：适用于大分子的分离或浓度小于0.5%时使用。

3、高筛分琼脂糖凝胶：主要用于100～1200bp的小片段DNA的分离，可分辨相差4个碱基的DNA。

4、低熔点琼脂糖凝胶（65℃）：适用于回收DNA段，保持凝胶中回收样品的稳定性和活性。

四、琼脂糖凝胶性能指标：

琼脂糖凝胶性能指标有电渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度和脱水收缩作用等。

1、电渗：

电渗是琼脂糖凝胶电泳中由多糖骨架上的带电基团引起的，主要是由硫酸酯和丙酮酸盐引起，这些阴离子基团被固定在载体中，相应的阳离子与其结合水一起向负极移动。

2、胶凝温度：

将琼脂糖凝胶在溶液中加热至90℃溶解后降温，由液态转变为固态时的温度即为凝固点，称为胶凝温度。

一般在35～43℃。

3、熔化温度：

将凝固的琼脂糖凝胶由固态转变为液态时的温度即为熔化点，称为熔化温度。

一般在75～90℃。

4、凝胶强度：

凝胶强度是指每平方厘米的琼脂糖凝胶所能承受的重量。

凝胶强度与凝胶浓度成正比。

5、脱水收缩作用：

脱水收缩作用是指由于琼脂糖凝胶骨架收缩使一部分液体从凝胶中分离出来的现象。

五、不同浓度的琼脂糖凝胶分离DNA段的范围：

1、凝胶总浓度：0.3%

dsDNA段的分离范围：5～60kb

2、凝胶总浓度：0.6%

dsDNA段的分离范围：1～20kb

3、凝胶总浓度：0.7%

dsDNA段的分离范围：0.8～10kb

4、凝胶总浓度：0.9%

dsDNA段的分离范围：0.5～7kb

5、凝胶总浓度：1.2%

dsDNA段的分离范围：0.4～6kb

6、凝胶总浓度：1.5%

dsDNA段的分离范围：0.2～3kb

7、凝胶总浓度：2%

dsDNA段的分离范围：0.1～2kb

六、特点：

1、优点：

（1）琼脂糖凝胶属于大孔胶，可分析分子量为10⁷的大分子，但分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫电泳和微量制备。

琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖凝胶浓度，琼脂糖凝胶浓度与平均孔径的关系如下：

1）琼脂糖凝胶浓度为0.075%时，平均孔径为800nm，可分析百万分子量的大分子。

2）琼脂糖凝胶浓度为0.16%时，平均孔径为500nm。

3）琼脂糖凝胶浓度为1%时，平均孔径为150nm。

4）琼脂糖凝胶浓度为2%时，平均孔径为20nm。

（2）物理化学性质稳定，结构均匀，含水量大（98%～99%），近似自由电泳，对蛋白质吸附极微，无拖尾现象，分辨率高，电泳图清晰，重复性好。

（3）机械强度较高，可在1%或更低浓度下使用且在这种浓度下仍有筛分和抗对流作用。制成干膜可长期保存。

（4）琼脂糖无毒，生物中性，不与生物材料结合。

（5）具有热可逆性，胶凝过程不用催化剂。

（6）因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂糖凝胶的电渗。

（7）电泳操作、染色、脱色简单快速，背景色较低，便于定量测定。

（8）透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色，放射自显影灵敏度高。

（9）不吸收紫外光，可直接用紫外吸收法定量测定。

（10）低熔点琼脂糖凝胶回收样品容易。

2、缺点：

（1）易破碎，浓度不能太低。

（2）易被细菌污染，不易保存，要用前配制。

（3）琼脂糖凝胶载体上的区带易扩散，电泳后必须立即固定染色。

（4）与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，分子筛作用小，区带少。

七、应用：

由于琼脂糖凝胶孔径相当大，对大多数蛋白质来说，其分子筛作用微不足道，广泛用于核酸的研究， 适用于分离200～50kb DNA段。

   

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