电泳仪是利用在电场作用下待分离样品中各分子带电性质、分子大小和形状等差异，使带电分子产生不同的迁移率，从而对样品进行分离。自由界面电泳仪没有支持介质，扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳仪，减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳仪的发展，使电泳仪成为分离蛋白质和核酸等生物大分子的重要手段之一。凝胶电泳色谱（简称凝胶电泳）最初使用的凝胶是淀粉凝胶，目前使用最多的是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

一、聚丙烯胺凝胶：

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH₂，简称Acr）和交联剂N，N′－甲叉双丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH－CO－CH = CH₂，简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）作用下聚合交联而成的三维网状凝胶，凝胶孔径大小由丙烯酰胺的浓度决定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳适于分离小分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析，装载的样品量大，分辨率高，回收DNA纯度高即能分离长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子。

（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：

在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率不同。

由于分子的空间结构影响，同等大小的DNA之间的电泳迁移率可相差10%。因此，不能用非变性聚丙烯胺凝胶电泳判断DNA分子大小。

（2）变性聚丙烯胺凝胶电泳：

1）DNA变性：采用加热、极端pH、有机溶剂、尿素或甲酰胺导致DNA解链。

2）凝胶中加入变性剂：5M的尿素，使DNA为单链线性，变性DNA的移动速度与其碱基组成和序列几乎完全无关。

变性聚丙烯胺凝胶电泳可用于DNA序列分析等。

二、琼脂糖凝胶：

琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的β－D吡喃半乳糖和1，4连接的3，6脱水β－D吡喃半乳糖组成，形成相对分子量为10⁴～10⁵的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时，链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接形成孔径结构，随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。

由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，常用过酸或过碱等破坏氢键形成的方法可使凝胶再溶化。

琼脂糖凝胶电泳分辨率稍低，适于分离较大分子物质。

1、一般琼脂糖凝胶电泳：

在一定浓度的琼脂糖凝胶中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比。

DNA分子的空间结构对电泳迁移率也有影响，共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。

2、脉冲电场凝胶电泳：

一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大，此时凝胶的分子筛效应不明显。若改变电场方向，则DNA分子会改变其构象，沿新的泳动方面伸直，电场转向时间与DNA分子大小关系极为密切。

脉冲电场凝胶电泳可分离1000～5000kb的DNA片段。

3、RNA琼脂糖凝胶电泳：

RNA琼脂糖凝胶电泳同DNA，只是用变性琼脂糖凝胶电泳，以防止RNA二级结构的形成。

关键是防止RNase污染，一般用DEPC（0.1%）焦碳酸二乙酯。

   

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